本罪的主体为特殊主体，即单位中对排除事故隐患，防止事故发生负有职责义务的主管人员和其他直接责任人员。这里的单位，根据《劳动法》第2条的规定，其范围非常广泛，既包括一切在中华人民共和国境内设立的企业和个体经济组织，也包括其他与劳动者建立了劳动合同关系的国家机关、事业组织和社会团体。
在司法实践中，重大劳动安全事故罪主要发生在从事生产、经营的企业和个体经济组织中。对排除事故隐患，防止事故发生负有职责义务的主管人员和其他直接责任人员，通常是指用人单位的法定代表人、厂长、经理、主管劳动安全和劳动卫生的副厂长、副经理，以及直接负责有关劳动安全和劳动卫生工作的安全员、电工等等。由于国家工作人员失职造成重大事故的，可以直接依照本法的规定，以他罪追究处罚，所以，本罪的主体中不包括国家工作人员。
